PHYTONXID-Kháng sinh thảo mộc

1. Khái niệm
Năm 1951: Oatman đã đa ra định nghĩa kháng sinh:
Chất kháng sinh là các chất hoá học do vi sinh vật tạo ra, có khả năng ức chế sự
phát triển của vi khuẩn và các vi sinh vật khác, thậm chí còn tiêu diệt chúng ở nồng
độ loãng.
Theo định nghĩa này, các chất tiêu độc có tính chất đơn thuần tổng hợp, các
hợp chất sunfamid furazolidon… đều không phải là chất kháng sinh. Ngược lại những
chất thuộc nguồn gốc vi sinh vật trước kia nay đã được điều chế bằng con đường tổng
hợp hay bán tổng hợp vẫn được gọi là chất kháng sinh: cloramfenicol, streptomycin,
tetracyclin, penixilin…
Ngày nay từ kháng sinh còn được mở rộng đối với hợp chất trị vi khuẩn được
phân chiết từ thực vật thượng đẳng. Người ta gọi những chất kháng sinh có nguồn gốc
từ thảo mọc này là kháng sinh thảo mọc hay là phytoncid.
Ngoài các chất trị vi khuẩn nh đã nói ở trên, ngày nay người ta còn xếp các chất
với nồng độ thấp có tác dụng trị nấm hạ đẳng gây bệnh, siêu trùng, Ricketsia,
nguyên sinh động vật cũng là chất kháng sinh.



2. Lịch sử tìm kiếm Phytoncid:
Trong lịch sử phát triển Y học của dân tộc ta cũng nh nhiều dân tộc khác trên
thế giới, trước khi có khái niệm kháng sinh nói chung và Phytoncid nói riêng, loài người
cũng đã từng sử dụng nhiều loại cỏ cây vào mục đích chống nhiễm trùng. Tuệ Tĩnh
(thế kỷ XIV) đã biết sử dụng nhiều loại thực vật có tính chất kháng khuẩn mạnh:
Tỏi, Hẹ, Tô mộc… trị các bệnh nhiễm trùng. Mãi về sau này (thế kỷ XIX) người ta
mới biết trong tỏi có alixin, hẹ có odorin, tô mộc có Brazilin là những hoạt chất có
tác dụng kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh.
Lịch sử tìm kiếm Phytoncid được bắt đầu từ việc tìm những tinh dầu thơm chế
từ thực vật có tác dụng trị bệnh.
Năm 1880 Davane đã nghiên cứu tính kháng khuẩn của lá bồ đào với
B.anthracis.
Năm 1887 R.Koch tìm thấy tính kháng khuẩn của nhiều loại tinh dầu.
Cùng năm, Chamberland học tró của Pasteur đã chứng minh rằng nhiều loại
tinh dầu có tính kháng khuẩn mạnh không kém gì axit cacbonic.
1928, B.P.Tokin đã gọi các chất bay hơi từ cây xanh có tác dụng đối với vi
khuẩn là Phytoncid.
Gần đây, ngày càng có nhiều tài liệu chứng minh rằng nguồn gốc kháng sinh
thực vật phong phú.
Đến năm 1961 đã khảo sát trên 20.000 loài thực vật để kiểm tra tính kháng
khuẩn của chúng.
ở Việt Nam, cũng từ những năm đầu của thập kỷ 60 (thế kỷ 20) phòng đông y
thực nghiệm do bác sĩ Nguyễn Văn Hưởng lãnh đạo, đã bắt đầu sử dụng các kỹ thuật
mới để điều tra các phát hiện tập đoàn kháng sinh thảo mộc. Ông đã xác định được
198 loài thực vật ở Việt Nam có Phytoncid. Bộ môn Dược Thú y Trường Đại học Nông
nghiệp I cũng trong thời gian này đã nghiên cứu và tuyển chọn được 28 loài thực vật
có tác dụng mạnh với các vi trùng gây bệnh trong thú y ở nước ta.
Phạm vi ứng dụng của Phytoncid trong Y học và Thú y và cả Thú Cưng học ngày càng rộng rãi.
Qua kết quả nghiên cứu của chúng tôi, việc sử dụng kháng sinh thảo mộc điều
trị có hiệu quả tốt các bệnh nhiệm khuẩn đường tiêu hoá, đường hô hấp, tiết niệu… của
thú cưng, gia cầm và ông mật… ở nước ta, đã khẳng định; mở ra một triển vọng tốt đẹp
trước mắt cũng nh lâu dài.


3. Phân Loại
Ngày nay người ta chia Phytoncid ra làm 2 nhóm sau:
a) Nhóm Phytoncid bay hơi
Là những Phytoncid do thực vật thượng đẳng tiết ra có khả năng khuếch tán vào
không khí và có tác dụng ức chế sự sinh trởng, phát triển của vi khuẩn.
Nói cách khác, Phytoncid bay hơi chính là các ether thực vật.
b) Nhóm Phytoncid không bay hơi:
Là những Phytoncid do thực vật thượng đẳng tiết ra. Nó ở sâu trong các tế bào
thực vật, không có khả năng khuếch tán vào không khí. Muốn sử dụng nó, phải dựa
vào đặc điểm, tính chất của từng loại Phytoncid. Thường người ta hay sử dụng chúng
dưới các dạng:
+ Giả nát lấy nước cốt cho uống
+ Ngâm, sắc.
+ Chiết bằng các dung môi thích hợp.


4. Ưu, nhược điểm của Phytoncid
1) Ưu điểm
+ Phytoncid được phân bổ khá rộng rãi ở giới thực vật, gần như bốn màu lúc nào
chúng ta cũng có sẵn Phytoncid để chữa bệnh cho thú cưng.
+ Cách chế biến.
+ Giá thành hạ.
+ Không gây nên các hiện tượng: Sốc, dị ứng, không có tác dụng phụ nh của các
kháng sinh nguồn gốc vi nấm, vi khuẩn.
Ví dụ: Streptomixin có ảnh hưởng xấu đến thần kinh thính giác, thần kinh 7…
Chloramfenicol ức chế sự tạo thành các tế bào non, nhất là các tế bào máu, tế
bào tinh trùng, dễ gây hiện tượng suy tuỷ và quái thai.
Penicilin gây hiện tượng dị ứng, sốc quá mẫn, còn kháng sinh thảo mộc không đa
tới hiện tượng dị ứng; ngược lại một số loại còn có tác dụng phòng, chống dị ứng nh
Brasilin và Brasilein của tô mộc, Inteolin của Kim ngân. Những chất này có tác dụng
khoa men histamin decarboxilaza, phản ứng sinh histamin bị đình lại; do hiện tượng
dị ứng không xẩy ra.
+ Thực tế cha có tài liệu nào nói về quá trình kháng Phytoncid tự nhiên của vị
trùng; còn trong phòng thí nghiệm của chúng tôi quá trình gây kháng nhân tạo của
E.Coli với Phytoncid xẩy ra rất chậm.
Ngược lại, quá trình làm mẫn cảm trở lại của E.Coli đã kháng Alixin, trong môi
trường canh than có thêm men tiêu hoá và cao mật lợn, lại nhanh hơn rất nhiều so với
việc làm mẫn cảm trở lại các vi khuẩn đã kháng Nitrofurantoin và Tetracielin.
2) Nhược điểm
Ở một số dược liệu, thời gian trồng cây có Phytoncid lâu hơn so với việc nuôi cấy
xạ khuẩn hay bằng con đường tổng hợp. Ví như trong tỏi, ta phải trồng và chăm sóc tỏi
4 tháng. Còn tô mộc thì ít phải có 7 năm tuổi mới có tác dụng chữa bệnh tốt.


II- Tìm một Phương pháp đại cương để nghiên cứu có hệ thống các chất kháng sinh
thảo mộc
Bước 1: Khảo sát hàng loạt để phát hiện những cây có tác dụng kháng sinh đối
với các vi khuẩn gây bệnh.
Bước 2: Chiết xuất tìm hoạt chất có tác dụng, kháng sinh.
Bước 3: Tìm hiểu tính chất lý, hoá học, xác định công thức hoá học của hoạt
chất; thông qua đó nghiên cứu cơ chế tác dụng của Phytoncid.
Bước 4: Tìm biện pháp để tiến tới tổng các chất kháng sinh này.
ở nước ta, các bước 1 và 2 đã và đang được tiến hành


A- Chuẩn bị thuốc thử
Trước khi làm kháng sinh đó, phải chuẩn bị một hay hai mẫu trong số tất cả các
dạng thuốc sau:
1) Dạng thuốc tươi
+ Giá nhỏ dược liệu tươi, lấy nước cốt.
+ Lấy nước cốt, pha thêm nước cất vào, với tỷ lệ pha loãng 1/10…1/100… (tuỳ
theo tác dụng kháng sinh của dược liệu đó mạnh hay yếu).
Nhược điểm: Nếu làm kháng sinh đó ở dạng này dễ lẫn nhiều tạp chất, gây khó
khăn cho việc nhận xét, đánh giá kết quả của vòng vỏ khuẩn.
2) Dạng thuốc sắc
Mục đích để kiểm tra hoạt chất kháng sinh có chịu được nhiệt không.
Ví dụ: Các Phytoncid ở dạng bay hơi một vài dạng Phytoncid khác, không chịu
được tác dụng cuả nhiệt. Nếu đem sắc, rồi thử, sẽ mất hoạt tính kháng sinh.
Ngược lại, các Phytoncid của tô mộc. Kim ngân, sắt đất… đem sắc đặc, rồi thử
thì hoạt tính kháng sinh vẫn không thay đổi.
3) Làm cao ở các dạng
Cao lỏng, cao đặc và cao khô để kiểm tra kháng sinh đỏ, cách này cho ta chọn
được các dược liệu có hoạt tính kháng sinh có chịu được nhiệt độ cao hay không? tác
dụng kháng sinh có bị thay đổi bởi quá trình chế biến không?
4) Phơi khô, nghiền bột rồi đập viên để thử
5) Chiết hoạt chất trong các dạng dung môi khác nhau:
Mục đích: Xem hoạt chất kháng sinh của dược liệu, tan tốt nhất trong môi trường
nào. Từ đó, ta lựa chọn Phương pháp chiết xuất. Để tránh các sai lầm trong khi bào
chế, và sử dụng dược liệu sau đây: khi thử hoạt lực kháng sinh, ta cần chú ý thêm một
số đặc điểm sau:
1) Về pH: Ta tiến hành thử hoạt lực kháng sinh của dược liệu trong các môi tr-
ờng pH khác nhau (Kiềm, trung tính, và toan tính) với mục đích xác định xem kháng
sinh có tác dụng tốt nhất trong môi trường pH nào? Nh thế nào có thể giúp lựa chọn
đường cho thuốc này.
2) Thử hoạt tính kháng sinh của Phytoncid dưới tác dụng của các men tiêu hoá.
Cách làm: Kiểm tra hoạt lực của Phytoncid dưới tác dụng của men tiêu hoá bằng
hai cách (chủ yếu và quan trọng nhất là thử với Pepsin và Trypsin).
Cách 1: Gồm 3 ống nghiệm sau:

ống nghiệm Thành phần 1 ống	1	2	3
Canh thang Phytoncid Men tiêu hoá	3 có có	3 có không	3 không có
Vi khuẩn thử (1 que Cấy)	Cấy đều vào cả 3 ống nghiệm

 
Sau đó chỉnh pH cả 3 ống nghiệm giống nhau và là pH của men tiêu hoá hoạt
động, tức là nếu ta dùng trypxin thì pH cả 3 ống là 7 – 7,5. Nếu là men peoxin thì pH
= 3 – 4. Đạt cả 3 ống trong tủ ấm 370C/24 giờ, sau đọc kết quả.
Kết quả dương tính: ống nghiệm 1 và 2 vi khuẩn không phát triển được, ống
nghiệm 3 vi khuẩn phát triển bình thường, ta dùng Phytoncid cho thú cưng uống được.
Ngược lại, nêú cả 3 ống nghiệm vi khuẩn đều phát triển thì với Phytoncid đó ta
phải tìm cách chế biến khác không chi thú cưng trong dược.
Cách 2: Cũng tiến hành tương tự nh cách một trong ống nghiệm nhưng trước khi
cấy vi khuẩn vào ống nghiệm, ta chọn men tiêu hoá tác dụng với Phytoncid, chỉnh
pH sinh lý, đạt tủ ấm 370/2 – 3 giờ lấy ta cấy tiếp vi khuẩn vào, đặt trở lại tủ ấm
12-18giờ sau đọc kết quả.
Cách đánh giá kết quả cùng giống nh cách 1:
3) Chế các dạng thuốc dưới dạng hỗn hơp nhiều loại Phytoncid
Mục đích: Xem những loại dược liệu nào phối hợp với nhau thì có tác dụng hiệp
đồng làm tăng khả năng chữa bệnh và ngược lại.
Ví dụ: Các dược liệu sau đây nên phối hợp với nhau sẽ có tác dụng kháng sinh
hiệp đồng.
Tô mộc với ngũ vị.
He tươi với vỏ tươi.
Ngược lại, các dược liệu sau đây nếu phối hợp sẽ làm mất tác dụng kháng sinh của
nhau:
Hoàng bá và phúc bồn.
Kim ngân với tô mộc, với hoàng bá.


B- Phương pháp tiến hành
Tuỳ theo yêu cầu và mục đích nghiên cứu. Bằng phương pháp thí nghiệm khác
nhau chúng ta có thể tiến hành cả định tính và định lượng Phytoncid.
1) Phương pháp định tính (làm trên thạch đĩa)
1- Mục đích:
Cho thấy rõ phạm vi tác dụng và những đánh giá sơ bộ về khả năng của loại
kháng sinh đó còn dang ở giai đoạn thô. Cần phân biệt cách thử giữa kháng sinh thô,
kháng sinh bay hơi giữa vi khuẩn hiếu khí và yếm khí. Có thể kết quả mới chính xác.
Hiện tại ở các cơ sở sản xuất, mới chỉ tiến hành thử Phytoncid thô với vi khuấn
hiếu khí bằng cách làm kháng sinh đó. Để đánh giá hiệu lực kháng sinh của thuốc
tuỳ hoàn cảnh thực tế chúng ta có thể làm một số cách làm kháng sinh đồ sau:
1) Cách tiến hành
a) Phương pháp đặt vòng khâu của Heathey
a.1. Chuẩn bị dụng cụ:
Vòng khâu: có thể là những vòng bằng kim loại đúc sắn không gỉ. ở các cơ sở
sản xuất, có thể thay bằng khâu thuỷ tinh có kích thước tương đương, đường kính 8 –
9mm. Chiều cao vòng khâu 9 -10mmm. Kinh nghiệm thực tế cho thấy khâu bằng
thuỷ tinh tốt, thuận tiện, dễ tiết kiệm, các cơ sở sản xuất tự tìm được.
Hộp lồng: gồm các kích thước đường kính 20cm, 10cm, và 8cm.
Các dụng cụ cần thiết khác của phòng thí nghiệm pipette, cốc đong, ống đong.
- Phương pháp đặt viên thuốc.
- Phương pháp khoét lỗ trên thạch rồi bơm bay trộn thuốc hoặc đặt viên thuốc
vào.
- Phương pháp bơm, phun vi khuẩn vào các chuông thuỷ tinh kín trong có các
đĩa thạch đã trộn kháng sinh cần thử, của Giáo s Đặng Văn Ngữ.
- Phương pháp đặt vòng khâu cảu Heathey. ở Việt Nam, hay dùng Phương pháp
này. Nó đơn giản, an toàn mà vẫn đảm bảo được độ chính xác. Phương pháp này có
mấy u điểm sau:
1) Trong lúc chuẩn bị các dạng thuốc để thử còn lẫn một số vi khuẩn khác, ống
khâu sẽ giữ vi khuẩn không cho khuếch tán ra ngoài thạch dược.
2) Một số tanin, gồm có trong thuốc cũng bị giữ lại trong ống khâu, không thể
khuếch tán vào thạch làm tủa pepton cũng nh thức ăn khác của vi khuẩn thí nghiệm.
3) Nếu ống nghiệm khâu đảm bảo tiêu chuẩn quy định, chỉ Phytoncid được thẩm
thấu vào thạch, rồi ức chế sự phát triển hay tiêu diệt vi khuẩn. Cho vòng vô khuẩn
to, nhỏ tuỳ thuộc tác dụng dược lý mạnh hay yếu của Phytoncid.

2. Chuẩn bị nguyên liệu
Các dạng thuốc thử cần thí nghiệm
Các loại vi khuẩn cần thử
Thạch: riêng về thạch vào hộp lồng, ta chuẩn bị 2 loại: thạch nền và thạch
trắng.
+ Thạch nền: Đặc hơn thạch trắng, thường là loại thạch kém phẩm chất hơn, được
nấu trong môi trường canh thang rất loãng. So với thạch trắng hàm lượng chất dinh d-
ỡng có ở thạch nền rất ít. Thạch này, sau khi đã hấp thanh trùng, đung nóng, chẩy
trở lại, tuỳ theo kích thước của từng loại hộp lồng mà ta đổ:
 

Với đĩa

V = 20cm ta đổ vào mỗi đĩa 25-30 ml thạch i = 10cm ta đổ vào mỗi đĩa 15ml thạch

= 8cm ta đổ vào khoảng 10 – 12ml thạch, chờ đông, bảo quản tủ
lạnh dùng dần.
+ Thạch tráng (thạch mặt): Là thạch bảo đảm đúng, đủ thành phần các chất
dinh dỡng để vi khuẩn phát triển nh: Huyết thanh, glucoza, các axit amin, vitamin...
nếu nh vi khuẩn thí nghiệm yêu cầu, lắc đều thanh trùng, đun nóng chảy hết, để
nguội 46-480C rồi cho vi khuẩn cần thử vào, lắc đều, chia các đĩa. Thường cứ 25ml
thạch tráng cho thêm 0,2 ml canh trùng thí nghiệm, sau khi cấy 24 giờ ở tủ ấm, lắc
thật đều, chia cho từng đĩa, mỗi đĩa tuỳ theo kích thước cho khoảng 3 -10ml thạch
trắng có canh trùng. Tráng khắp mặt đĩa. Nh vậy trong từng đĩa sẽ có 2 lớp thạch:
Lớp thạch nền: chắc hơn, dày hơn ở phía dưới
Lớp thạch mặt: mỏng hơn, lỏng hơn đã có vi khuẩn cần thử ở phía trên.
Sau khi lớp thạch trên da đóng lại, ta tiến hành đặt khân: khâu sâu khoảng 1 –
2mm (tức chân của khâu vừa chạm tới mặt của lớp thạch nền). Nhỏ thuốc thử kháng
sinh vào. Để tủ lạnh 6 – 8giờ chờ cho chất kháng sinh thẫm thấu vào lớp thạch mặt,
nhưng vi khuẩn cha mọc.
Tiếp đó để tủ ấm 370C; khoảng 12 – 18 giờ sau, đọc kết quả.
Do đường kính vòng vô khuẩn, là đường kính đi qua tâm vòng tâm khâu, tới mép
vòng vô khuẩn. Số lượng địa thạch yêu cầu được tính theo công thức:
X = AxB/C

X	: Số đĩa thạch cần chuẩn bị
A	: Số lượng cây thuốc (mẫu) cần thử.
B	: Số vi khuẩn cần thử.
C	: Số lượng vòng khâu đạt trong từng đĩa.

Với phương pháp này chúng ta cũng có thể tiến hành định lượng, hàm lượng
Phytoncid có trong dược liệu được khi so sánh với chất chuẫn.
Cánh đánh giá kết quả: tuỳ theo mc độ mẫn cảm của vi khuẩn với từng loại
thuốc cần thử mà ta chia ra các mức độ sau:
Vi khuẩn rất mẫn cảm với thuốc: đường kính vòng vô khuẩn sẽ lớn hơn 30mm .
Thuốc xẽ có tác dụng rất tốt trong điều trị .
Vi khuẩn ít mẫn cảm với thuốc, đường kính vòng vô khuẩn khoảng 20-30mm với
thuốc này muốn điều trị ta phải tăng liềuđiều trị lên so với liều đang dùng .
Vi khuẩn không chịu tác dụng của thuốc thì xung quanh ống khuẩn xẽ không
xuất hiện vòng vi khuẩn .Thuốc này xẽ không được dùng trong điều trị .
b) Phương pháp của giáo sư: Đặng Văn Ngữ
Các mẫu dược liệu cần nghiên cứu đem nghiền nát thành bột rồi nén thành viên
bánh trụ cao 0,8cm đường kính 0,3cm đạt viên vào hộp lồng đã có thạch để tủ lạnh
40C /6h chờ hoạt chất kháng sinh từ khuyếch tán ra ngoài môi trường. Sau lấy hộp
lồng từ tủ lạnh ra, đặt vào chuông thuỷ tinh có chứa các đĩa thạch kể trên. Chuyển
thạc đĩa vào tủ ấm 370C trong 12 giờ sau đọc kết quả bằng cách do vòng vô khuẩn
xung quanh chân viên nén.
Phương pháp này tránh được việc sử dụng các khâu nhưng lại phải dùng những
phương tiện cồng kềnh khác: Máy nghiền dược liệu, máy nén viên trụ…
Chú ý: Phương pháp này rất nguy hiểm nhất là khi nghiên cứu những loại vi
khuẩn gây bệnh chung giữa thú cưng và người.
c) Phương pháp thử các Phytoncid bay hơi với các vi khuẩn hiếu khí:
Có nhiều cách làm, ở đây chúng tôi giới thiệu phương pháp của giáo s Rudat ng-
ời Đức. Phương pháp này được áp dụng phổ biến hơn cả. Cách làm nh sau:
Lấy 2 nữa hộp lồng có đường kính bằng nhau. Nửa trên của hộp lồng ta đổ thạch
và cấy vi khuẩn cần thử. Nửa dưới hộp lồng ta đặt chất thuốc là những Phytoncid bay
hơi (dược liệu giã nhỏ, tinh dầu nguyên chất, bông tẩm nước cốt của dược liệu…).Gắn
parafin đặt tủ ẩm 37oC/12 giờ đọc kết quả. Nếu kháng sinh bay hơi này có khả năng
ức chế vi khuẩn thí nghiệm, thì nửa trên của hộp lồng, vi khuẩn không mọc, hay mọc
rất ít so với đối chứng.
d) Phương pháp thử Phytoncid với vi khuẩn kỵ khí
Phương pháp này được áp dụng chủ yếu ở các cơ sở nghiên cứu: Cục, Viện và Trường của Trung ương để đảm bảo tính chất an toàn khi nghiên cứu một dược liệu nào
đó, còn ở các cơ sở sản xuất: các Chi cục Thú y và trại chăn nuôi tập thể… hiện nay
cha áp dụng.
Trước khi tiến hành Phương pháp nay, ta phải loại bỏ hết tạp chất gồm: tanin,
gôm, protein của dược liệu. Rồi bằng Phương pháp làm lạnh, để lấy hết không khí
trong môi trường nuôi cấy đi. Cho dược liệu thí nghiệm. Với các nồng độ khác nhau
vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Đặt ống nghiệm vào tủ ấm 370C trong 12 giờ sau
đọc kết quả.
Phương pháp này hiện nay còn một số điểm cha thống nhất phải tiếp tục nghiên
cứu để hoàn chỉnh thêm.
Trong thực tế ta có thể nuôi vi khuẩn ở môi trường nước thịt có gan phía trên
tráng một lớp dầu parafin để tạo môi trường yếm khí. Sau khi cho các Phytoncid cần
thử và cấy vi khuẩn vào, ta cũng đặt tủ ấm 370C/12 giờ sau độc kết quả.
Nếu ống nghiệm vẫn trong suốt, giữ nguyên mẫu canh thang, tức là vi khuẩn
không phát triển được, chứng tỏ Phytoncid đó có tác dụng chống vi khuẩn yếm khí.


2) Phương pháp định lượng
Mục đích của Phương pháp:
Định lượng cho ta biết được mức độ tác dụng mạnh của Phytoncid. Thường sử
dụng các Phương pháp sau để tiến hành định lượng.
1) Phương pháp hệ nống độ pha loãng
Nó được áp dụng rộng rãi khi nghiên cứu vi khuẩn học và tính chống chịu kháng
sinh ở cả 2 loại môi trường đặc biệt (thạch) và lỏng (canh thang).
a- Trong môi trường đặc: Dung dịch chất cần thử (Phytoncid) đã pha sẵn trong n-
ớc cất vô trùng, nồng độ 1/10: 1/100 sau đó cứ 1ml chất thử ở các nồng độ khác nhau
đem trộng đều với 4ml môi trường thạch ở 45-480C trong ống nghiệm vô trùng, lắc
thật đều để yên cho môi trường đông lại, sau đó nuôi ống cây một vật nhỏ vi khuẩn
cần thử lên mặt thạch, đặt tủ ấm 370C/12 – 18 giờ sau đọc kết quả, ta tìm được nồng
độ thấp nhất có tác dụng của thuốc với vi khuẩn. Đó là nồng độ tối thiểu tác dụng
của chất kháng sinh.
b- Trong môi trường loãng: Phương pháp này đã được Fleming dùng để xác định tác
dụng dược lý của Penixilin. Phương pháp này cũng cơ bản giống Phương pháp trên nhưng
được thay 4 ml thạch bằng 4ml canh thang và cấy vi khuẩn cần thử vào. Yêu cầu của
Phương pháp này: số lượng vi khuẩn cấy vào từng loại nồng độ giống nhau. Thường là
lấy 1 que cấy.
Yêu cầu chung của Phương pháp hệ nồng độ pha loãng là:
+ Số lượng vi khuẩn trong từng nồng độ phải được xác định và ít nhất là phải
giống nhau về số lượng vi khuẩn.
+ Vi khuẩn thí nghiệm phải nuôi trong môi trường luôn luôn có các thành phần
giống nhau với nhiệt độ xác định và tuổi giống nhau.
+ Trong môi trường loãng, muốn có kết quả chính xác về nồng độ tối tiểu tác
dụng, ta có thể chọn 2-3 ống nghiệm liền nhau ở nồng độ nghỉ ngờ , cấy lên 2-3 đĩa
thạch để tủ ấm 24 giờ (mỗi ống cấy 1 đĩa). Nếu vi khuẩn ở đĩa nào không mọc (nhưng
phải liền với ống có nồng độ thấp hơn vi khuẩn vẫn mọc). Ta gọi nồng độ ở đĩa đó là
nồng độ tối thiểu tác dụng của Phytoncid với vi khuẩn cần thử.
2) Phương pháp khuếch tán:
Phương pháp náy được áp dụng phổ biến ở các cơ sở sản xuất do Reddish tìm ra
năm 1920 sau đó được Abranam (1941) cải tiến để xác định hàng loạt tính kháng
khuẩn của penixilin.
Nội dung và Phương pháp tiến hành nói chung giống Phương pháp đặt khâu của
Healley, chỉ khác: mỗi một ống khâu trong hộp lồng ta nhỏ một loại nồng độ kháng
sinh nhất định. Trong từng hộp lồng ta nên bố trí xen kẽ có khân nhỏ dung dịch
chuẩn đã biết trước nồng độ để sau này đánh giá, so sánh xem mức độ tác dụng của
từng nồng độ so với thuốc chuẩn. Đặt hộp lồng vào tủ 370C/12 – 18 giờ sau đọc kết
quả.
3) Phương pháp xác định độ đục
Phương pháp nàu rất chính xác và nhanh, chỉ trong vòng 2-3 giờ chờ vi khuẩn
mọc.
Phương pháp này dựa trên cơ sở quan hệ số học giữa mức độ kìm hãm sự phát
triển của vi khuẩn với nồng độ của Phytoncid có trong dung dịch.
Người ta pha loãng dung dịch chuẩn của Phytoncid ở các nồng độ khác nhau nh
phương pháp hệ nồng độ pha loãng. Dung dịch này đem trọng vào môi trường canh
thang. Cấy vi khuẩn vào. Mỗi ống nghiệm một que cấy vi khuẩn để khống chế nồng
độ vi khuẩn trong từng ống là giống nhau. Đặt tủ ấm 370C sau 2 – 3 giờ. Ta có thể đo
độ đục của môi trường để biết tốc độ phát triển của vi khuẩn, bằng máy đo quang kế
Spekol hoặc các pek ở phòng thí nghiệm.
Nồng độ tác dụng của dung dịch Phytoncid cần thử được tính theo mức độ tác
dụng của dung dịch Phytoncid chuẩn đã biết trước nồng độ.
Phương pháp này yêu cầu hàng ngày xác định đồ thị của nồng độ dung dịch
chuẩn.